摘要
骨髓中的髓系祖细胞产生单核细胞，巨噬细胞，粒细胞和大多数树突状细胞。即使这些先天免疫细胞属于同一谱系，每种细胞类型在组织发育，宿主防御和适应性免疫的产生中也发挥着特定而关键的作用。过去已经开发出从骨髓细胞分化出髓系细胞的方案，以进行功能研究，并加深我们对它们对哺乳动物生理学贡献的理解。在该protocol中，我们描述了一种简单快速的方法，可从mouse骨髓中分离出单核细胞，将其培养长达5天，最后将它们分化为源自骨髓的巨噬细胞（图1）。
图形摘要：
技术方案亮点：
1）直接离心取骨髓，不用反复冲洗。
2）单核与巨噬细胞的培养与分化
1.实验概述：鼠单核细胞和巨噬细胞培养的步骤
背景
造血系统的先天免疫细胞构成了髓系细胞，例如单核细胞，巨噬细胞，粒细胞以及大多数树突状细胞（DC）。这些细胞是感染或组织损伤的主要传感器，并通过抗原呈递，启动淋巴细胞和细胞因子产生，为适应性免疫提供了桥梁。
为了研究原代细胞中的髓系细胞生物学，研究人员开发了几种方案，可以直接从原代组织中分离单核细胞或巨噬细胞，或从造血祖细胞中产生骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）。BMDM可以培养维持数天，并且可以通过在含有M-CSF/CSF1的培养基中培养分离出的骨髓来生成（Freundetal。，2020;Geissmannetal。，2010;Helftetal。，2015年）。树突状细胞（DC）可以通过在含有GM-CSF/CSF2或FLT3L的培养基中分化来产生。尽管两个系统都产生了髓系和DC亚群的混合细胞群，但FLT3L允许分化产生多个生理相关的亚群，如浆细胞样DC（pDC），CD8+和CD8-DC（Jakubzick，2017;Naik，2005）。
我们的protocol描述了如何从骨髓中分离单核细胞，并培养和维持这些细胞数天的方案。此外，我们描述了一种从分离的胫骨和股骨中分离出总骨髓的快速方法，可实现最大程度的细胞恢复和存活。我们的技术克服了BMDM培养需要特定条件培养基（例如从L929细胞）的确定，并缩短了通过抽吸或冲洗来收集骨髓的漫长过程。
综上所述，这些技术方案可实现骨髓的快速，简单分离，并为高产率的培养原代单核细胞和巨噬细胞提供了基础，这对于下游研究如基因编辑，功能基因组学或过继性细胞转移是一个重大利好（Zhangetal，2008）。
材料和试剂
1.细胞刮板
2.70µm尼龙无菌细胞过滤器
3.G18针
4.0.5ml微量离心管
5.1.5ml微量离心管
6.50ml离心管
7.未经组织培养处理的6孔板
8.血移液器
9.低附粘附板培养皿
10.DMEM高葡萄糖培养基
11.EasySep单核细胞分选试剂盒（StemcellTechnologies，目录号：19861）
12.双抗青霉素/链霉素
13.重组鼠巨噬细胞集落刺激因子（rmM-CSF）
14.GlutaMAX
15.胎牛血清（FCS）
16.氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液
17.无菌PBS
18.重组鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）
19.重组鼠白细胞介素4（rmIL-4）
20.巨噬细胞培养基
设备
1.移液器
2.台式离心机
3.微量离心机
4.37°C的水浴
5.层流罩
6.细胞培养箱
7.无菌剪刀
8.无菌钳
实验步骤
A.骨髓提取（图2）
1.使用机构批准的协议对小鼠实施安乐死。
2.使用无菌镊子和剪刀分离股骨和胫骨。
3.去除残留在骨骼上的肌肉或组织。
4.将分离的骨头浸泡6孔板的PBS中，置于冰上，直至进一步处理。
5.将G18针推入0.5ml微量离心管的底部，产生一个小孔。
6.将0.5ml微量离心管放在更大的1.5ml微量离心管中。
7.小心地将切断两端的股骨和胫骨（最多1个股骨和2个胫骨）放入嵌套在1.5ml试管中的0.5ml微量离心管中，然后盖上盖子。
8.将试管以10,000×g离心30s。
9.丢弃装有骨头的0.5ml微量离心管，他们应该没有骨髓。
10.将获得的骨髓重悬于1mlACK裂解缓冲液中，并在室温下孵育2分钟。
11.将0.70µm无菌过滤器放在50mlFalcon管中。
12.将骨髓悬浮液过滤到试管中，并用10mlPBS洗涤过滤器。
13.添加额外体积的30mlPBS冲洗滤器；丢弃过滤器。
14.盖上管盖并以350×g离心4分钟。
15.轻轻倒出以除去PBS，保留骨髓沉淀。
16.如果需要，通过轻轻地重悬沉淀来重复PBS洗涤。
17.对分离的骨髓细胞进行计数。
图2.骨髓分离步骤的实验轮廓
B.单核细胞的分离和培养
1.骨髓分离后，根据生产商的说明，使用Easysep单核细胞分离试剂盒分选富集单核细胞。
2.分离的单核细胞可以在补充有5ng/mlrmGM-CSF和2.5ng/mlrmIL-4的巨噬细胞培养基中培养最多5天。单核细胞应以1×106细胞的密度以2ml终体积接种在未经组织培养的6孔板中。
3.如果需要，可以在第5天对Ly6C阳性，F4/80阴性，MHCII阴性和CD11c阴性的单核细胞进行分选（图3）。
图3.新鲜分离和培养的单核细胞的流式细胞仪分析。
新鲜分离和培养的单核细胞的Ly6C，F4/80，CD11b和IA/IE的表面标志物表达实例。单核细胞被鉴定为Ly6C高，F4/80低，MHCII低和CD11c低。
C．分化为骨髓源性巨噬细胞（BMDM）
1.添加50ng/mlrmM-CSF到巨噬细胞培养基，并在水浴中预热至37°C。
2.在20ml巨噬细胞培养基中悬浮12×106分离的总骨髓细胞（来自过程A）或富集的单核细胞（过程B），接种于15cm非组织培养处理的培养皿中。
3.将培养皿置于细胞培养箱中，37°C和5％CO2，共培养5天。
4.在第3天，添加20ml新鲜补充的巨噬细胞培养基，不用去除原始培养基。
5.在第5天，在显微镜下确认分化的BMDM的贴壁性。通过流式细胞仪评估分化效率（图4）。
分化的静息巨噬细胞可鉴定为Ly6C低，F4/80高，CD11c低和I-A/I-E低。
6.对于下游分析，请去除培养基，并用20ml无菌PBS中轻轻洗涤第5天的细胞。加入5ml巨噬细胞培养基，使用细胞刮刀小心地将细胞从培养皿上刮下。如果需要，用另外的5ml巨噬细胞培养基洗涤培养皿以收集更多的细胞。
7.计数收集的细胞，并以所需的细胞密度（典型密度为0.5x106细胞/ml）重悬于补充有50ng/mlrmM-CSF的巨噬细胞培养基中。将细胞接种到所需规格的经组织培养处理的培养皿上。
8.如果需要的话，在第5天，可以通过分选Ly6C低，F4/80高，CD11c低和I-A/I-E低的细胞，富集静息期的巨噬细胞。
培养基配方
1.巨噬细胞培养基：DMEM高葡萄糖培养基10％FBS1×GlutaMAX1×青霉素/链霉素
